实时荧光定量PCR方法检测小RNA

中国细胞生物学学报 C h i n e s e J o u r n a l o f C e l l B i o l o g y 2 0 1 0, 3 2 ( 3 ): 3 5 9— 3 6 0

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实时荧光定量 P C R方法检测小 RN A 贺小宏， 刘默芳 ( 兰州大学生命科学院，兰州 7 3 0 0 0 0; z中科院上海生命科学研究院生化细胞所 R NA研究技术平台，上海 2 0 0 0 3 1 )

R e a l— t i me Q u a n t i t a t i v e P C R De t e c t i n g S y s t e m,即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检 测系统，简称定量 P C R( q P CR )。荧光定量 P C R一般分为非特异性荧光定量 P C R和特异性荧光定量 P C R。 本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量 P C R(以S YB R G r e e n I为例 )方法对小 R NA进行定量分析。S Y B R G r e e n I q P C R分析小 R N A的优点为：实验设计简单，一般需要一条特异性反转录引物，一条特异性正向 P C R

引物，反向 P C R引物可通用于所有小 R NA分析，无需象 T a q Ma n方法那样专门设计探针；实验成本相对较低； 可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术，而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下：

1 TRI z o J法提取总 RNA ( 1 )对于贴壁培养细胞，可先去掉培养基，用P B S 洗 2次，然后按每 1 0 c m2面积加 l ml T R I z o l,用移液

p r i me r )、正向 P C R引物和通用 P C R反向引物。以

人mi R . 1 6为例，我们设计环状反转录引物序列为：5’ . CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA

器反复吹打数次使细胞彻底的裂解 (如果裂解液比较粘稠，可适当增加 T R I z o l用量),然后将裂解液收集 于1 . 5 ml E p p e n d o r f ( E P )管中。

G T T G AG C G C C AA T A. 3’,正向P C R引物序列为： 5’一 ACA CTC CAG CTG GGT AGC AGC AC

G TAA ATA一

3 ,反向P C R通用引物序列为： 5 ' - C T C A AG T G T C G T GGA GTC GGC AA一 3。。

( 2 )在l ml T R I z o l细胞裂解液中加入 2 0 0 1氯仿，颠倒数次混匀至裂解液呈粉红色为止，室温静置 3分钟， 4℃ 1 2 0 0 0 r p m离心 1 5分钟分离。这一步

( 2 ) R T反应体系。以 1 O l反应体积为准，加入 2 l 5x pr i me r Sc r i pt bu f f e r、0 . 5 l pr i me r Sc r i pt RT

比较关键，未完全混匀将导致离心后上清液呈现为红 色而不是透明相。

E n z y me Mi x I、0 . 5 1 l o o p e d R T p r i me r ( 1 0 l a mo l/ L )、

5 0 0 n g R NA,最后加 R Na s e— f r e e H, 0至 1 0 H l l。

( 3 )取上清置于另一 E P管中，加5 0 0“ l异丙醇室温静置 1 0分钟后， 4℃ 1 2 0 0 0 r p m离心 1 0分钟。 ( 4 )用移液器小心吸取上清，可看到管壁底部有白色片状沉淀，注意不要将白色片状沉淀吸入枪头。 加入 l ml 7 5%乙醇，于4℃7 5 0 0 r p m离心 5分钟。 注意缓慢加入 7 5%乙醇，避免将白色片状沉淀吹散。 ( 5 )尽量去除乙醇，置E P管于超净工作台 5分钟左右，使残余的乙醇完全挥发后，用5 0 u 1无R Na s e

( 3 )反应条件。针对不同的反转录酶，根据产品 说明进行设计。

3荧光定量 P CR反应 ( 1 )反应体系。以 2 O l反应体积为准，加入 1 0 山S Y BRG r e e n P C RMa s t e r Mi x(一般占反应体系的 1/ 2 )、0 . 5 l上游引物 ( 1 0 k t mo l/ L )、0 . 5 I . t l通用引物 ( 1 0￣ t mo l/ L )、1 稀释 1 0倍R T产物，最后加 R N a s e— f r e e H2 0至 2 0 l。

H, O溶解。为使溶解完全，可将 E P管置于 6 0￣ C水浴 1 O分钟。总 R NA溶液用于后续实验或冻存于一 8 0℃低温冰箱。

( 2 )反应条件。不同产品所使用程序不一样，一

般按照其说明进行 R e a l— t i me P C R设置。

2茎环反转录小 R N A的 c D NA合成 ( 1 )引物的设计。该方法定量分析小 R NA水平共需要 3条引物，分别为环状反转录引物 ( 1 o o p e d R T 通讯作者。T e l: 0 2 1 . 5 4 9 2 1 1 4 6, F a x: 0 2 1— 5 4 9 2 1 0 1 1,E— ma i l mf li u@s i b s . a c . c n

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