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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。一、 材料准备

1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。过硫酸铵配制成10%溶液后,分装成小管-20℃保存,通常半年内有效。

1. 10%十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷,当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。配制方法:10g SDS,用双蒸水溶解并定容至100ml,室温保存。2. 10%过硫酸铵(Ap):引发剂。能产生自由氧基,使丙烯酰胺聚合。

配制方法:0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解,应新鲜配制。过硫酸铵配制成10%溶液后,应当-20℃保存。同时应尽量减少室温存放时间,以防失效。

3. N、N、N’、N’-四甲基乙二胺(TEMED):促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固,其碱基催化AP产生氧自由基,激活单体形成自由基,发生聚合。TEMED易挥发,使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切,可通过适当调节TEMED的用量,控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

配制方法:原液使用。应使用电泳级TEMED。

4. 30%丙烯酰胺凝胶贮液(Arc-Bis贮液) : 含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。 丙烯酰胺单体(Arc)在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis),交联剂。丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。

配制方法(50mL体系):14.55 g丙烯酰胺+0.45 g N,N-甲叉双丙烯酰胺,先用40ml双蒸水溶解,搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至50 ml,0.45μm滤膜过滤。用棕色瓶储存于4℃(丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应,会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸,储存液应测定pH值不超过7.0。丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存,每隔数月须重新配制。丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性,并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量时必须戴手套和面具。)

5. 分离胶缓冲液(pH8.8的Tris-HCl缓冲液):1.5M Tris-HCl,pH8.8。

配制方法:9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中,用4 mol/L盐酸调节pH值8.8,再用双蒸水加至50ml。4℃保存。

6. 浓缩胶缓冲液(pH6.7的Tris-HCl缓冲液):1.0M Tris-HCl,pH6.8。

配制方法:6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中,用4 mol/L盐酸调节pH值6.8,再用双蒸水加至50ml。4℃保存。

7. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液:125mM Tris,1.25M甘氨酸,0.1% (m/v) SDS,pH8.3。

配制方法:在900 ml去离子水中溶解15.1g Tris和94 g甘氨酸(电泳级)(pH8.0),然后加入50 ml 10% SDS(电泳级)或5g SDS,用去离子水补至1000 ml。

8. 1×SDS样品缓冲液:50mM Tris-Cl(pH6.8),100mM DTT,2%(m/v)SDS,0.1%(m/v)溴酚蓝,10%(v/v)甘油。不含DTT的1×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液,临用前加入。

5×SDS样品缓冲液:250mM Tris-HCl (pH6.8),500mM DTT,10% (m/v) SDS,0.5%(m/v)溴酚蓝,50%(v/v)甘油。不含DTT的5×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液,临用前加入。

9. 考马斯亮蓝染色液:将0.25 g考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250溶解在90ml甲醇:水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中,用滤纸过滤,室温保存。

10. 脱色液配制方法:90ml甲醇:水(1:1)溶液和10ml冰醋酸的混合液。11. 蛋白质分子量标准物(marker)

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