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如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因_

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(收稿日期:200r7聊-10)

(本文编辑:唐栋)

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如何利用辞No珊软件筛选基因表达测定的内参基因?

答:随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法,基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用。采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围,理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达。管家基因是维持细胞最低限度功能不可少的基因,在所有类型细胞中都表达,是广泛应用的内参基因。但是,很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定,甚至差别很大,至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因。因此,对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价,筛选出最为稳定的管家基因作为内参基因,对保证研究结果的真实、可靠至关重要。

V蚰de∞mpele等(2002年)开发了geNo硼这一用于微软Excel平台的VBA宏程序,用于荧光定量PcR中候选内参基因的稳定性评价及确定合适的内参基因数,该程序可从互联网上免费下载。其依据的原则是两个理想内参基因表达水平的比值应该在所有标本中一致,不论在何种实验条件或者细胞类型。该法不受基因间表达丰度差别和极端比值的影响,比值变异度的增加意味着二者中其一或全部基因表达稳定性的降低。通过计算某一基因与其他所有基因间两两比值的对数转换值的平均变异度Ⅳ作为基因稳定性的评价指标,即:首先将荧光定量PCR得到的循环阈值(ct)转换

(胡金川)

为相对定量数据,方法是找到最低ct值的基因(表达量最高),用所有其他基因的Ct值减去最低Ct值,得到△ct,其值≥O,每个基因相对于最高表达水平基因的相对表达量为2也Q。然后制作Excel表格,列标题为标本名称,行标题为基因名称,将计算得到的各标本各个基因的2也。数值输入表格。将该文件保存到geNo册安装文件夹下,关闭所有Excel

程序。启动geNo珊程序,根据操作说明点击自动分析按钮,

程序自动给出膨值折线图,该图显示了逐步去除最不稳定表达的内参基因过程中每一步骤各内参基因平均表达稳定性数值肘,肘值越小,基因表达越稳定,该图对各管家基因稳定性进行了排序。再次点击自动分析按钮,将给出配对变异

分析%川结果图,该图显示了需要选择内参基因的数目,

建议y<O.15为选择阈值,如‰<O.15,表明只需选择2个

内参基因作标准化指标。利用该程序,研究者可以对特定研究的多个管家基因进行筛选,选出2个以上管家基因作为内参,有助于校正系统偏差以得到更可靠的结果,这对于基因的准确定量,尤其是细小表达差异的基因表达研究具有极其重要的价值。

(收稿日期:2008舶-13)

(本文编辑:张莉)

如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因_

万方数据

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