细胞处理

1 冰存细胞悬液的制备

(1)按常规方法消化处于对数生长期的A549细胞培养物，制备单细胞悬液，将细

胞悬液以2000rpm离心5min，去上清液；

(2)向细胞沉淀物中加入冰冻保护液(9：1血清：10％DMSO)轻轻吹打混

匀，使细胞密度达l×106_1×107个／ml；

(3)按每管l ml的量分装于冰存管内，拧紧管盖，封口膜封VI；

(4)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期

2细胞复苏

(1)从液氮罐中取出A549细胞后迅速放入37"C水浴中，约80％的细胞解冻

后拿出水浴；

(2)用移液枪转移细胞悬液至离心管；

(3)以2000rpm离心8min：

(4)弃上清，1640完全培养液，吹打、混匀，放入C02培养箱培养。

3传代培养

(1)待细胞长满培养瓶，将培养液弃去；

(2)PBS清洗培养瓶，弃液后加入1ml 胰酶(含EDTA)；

(3)轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，放入C02培养箱静置2min,

待细胞层略有松动，肉眼可见到流砂状时，加1640完全培养液终止消化，轻轻

吹打瓶壁，吸取细胞至离心管中.

(4)以2000rpm离心5min：

(5)加入2m l640完全培养液，用移液枪将细胞沉淀吹打成悬液，加入两个培养瓶， 各加入1640培养液7ml，置于37℃下继续培养。第二天观察

细胞生长情况。

4收集细胞

种植8个培养皿的细胞，用含有5000ug／ml茶氨酸浓度的 l640完全培养液处理A549细胞各0h, 15min, 30min, 1h, 2h, 6h, 12h, 24h, PBS缓冲液漂洗细胞2次；

5 蛋白样品制备

1、 倒掉培养液，向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min

2、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中（注意冰上操作）

3、 于4℃下12000rpm离心5min。

4、 将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中放于-80℃保存。

6 蛋白含量的测定

1. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶

液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

2. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀

释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简

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