应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

西北大学学报(自然科学版)

2009年2月,第39卷第1期,Feb.,2009,Vo.l39,No.1JournalofNorthwestUniversity(NaturalScienceEdition)

应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

杜燕华,黄 亮,党倩丽,陈 超,崔亚丽,肖 明

郑州 450052;3.陕西省人民医院皮肤科,陕西西安 710068)

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(1.西北大学生命科学学院;国家微检测系统工程技术研究中心,陕西西安 710069;2.河南工业大学生物工程学院,河南

摘要:目的 应用液态悬浮芯片技术,建立一种新的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法。方法

TM

应用通用引物从HPV基因组中扩增出目的片断,与13型荧光微球偶联探针杂交,通过Luminex100检测HPV的型别。结果 检测十三型标准株质粒,对单一标准品和混合标准品均可准确分型。结论 初步建立了高通量、快速、可靠、适用于临床的人乳头瘤病毒分型基因诊断方法。关 键 词:人乳头瘤病毒;液态悬浮芯片;基因分型

中图分类号:R446 文献标识码:A 文章编号:1000 274 (2009)01 0075 04 人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是一种双链DNA病毒,通过人体接触传播。迄今为止,全世界已发现逾100种HPV基因型。HPV感染的潜伏期长,不易在体外培养,亚临床感染常见,加之血清学试验又不能区别近期和远期感染。因此,对HPV感染的分型诊断,目前主要依赖分子生物学手段对病毒DNA检测。液态悬浮芯片技术是由美国Luminex公司推出的一个多功能分析平台。该技术可用于高通量特异性DNA系列分析、免疫学检测以及蛋白-蛋白相互作用等研究,目前已应用于HLA分型、分析 地中海贫血基因突变类型

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等多方面。本实验利用液态悬浮芯片高通量、快速可靠等特点,结合HPV分型的实际需求,选择13种高、低危HPV型别(这些类型占外生殖器部位感染类型96%左右)作为研究对象,建立了HPV基因分型的新方法,以探索这一新的技术在临床应用中的实用价值。

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士赠送,HPV45,51,53三型标准质粒由德国海得堡癌症研究中心Villiers博士赠送,HPV58型标准质粒由日本ToshihikoMatsukura博士赠送。1.2 主要仪器及试剂

Luminex100仪器购自美国Luminex公司,PCRSystem9700购自GeneAmp公司。EDC购自Pierce公司;TMA(Lot043K8408),MES(Lot042K5469)均购自Sigma公司;SAPE(Lo:t83C2 1)购自MolecularProbes公司。引物和探针由三博远志生物技术公司合成。荧光微球购自美国Luminex公司。

1.3 实验原理的构建

HPV的分型主要根据其基因组的同源性不同分型,作为新的一型HPV,其基因组可被完全克隆,L1,E6及E7开放阅读框与其他型基因组比较,具有低于90%的同源性

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TM

。本方法选择HPVL1区通

用引物GP5/GP6,并在其下游引物5 端标记生物

1 材料与方法

1.1 标准株质粒

含全长基因组的HPV6,11,16,18,33,52六型

标准质粒由第四军医大学分子生物学研究室赠送,HPV31,35,56三型标准质粒由美国AttilaLorincz博

收稿日期:2007 03 16

素,以样品中基因组DNA为模板,扩增出约150bp的序列,作为检测的靶点。针对13型HPV(6,11,16,18,31,33,35,45,51,52,53,56,58)在L1区的差异分别选择型特异型探针

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;以荧光微球为载体,

将13种探针一一对应的偶联至13种编码的荧光微球。检测时,向同一反应管中加入13种偶联有探针

基金项目:国家863重大专项基金资助项目(2002AA2Z2031)作者简介:,女,,

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