试验一 SOD

试验一： 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化

及活力测定

一、原理

超氧化物歧酶(Superoxidedismutase,SOD)是一种能专一地清除超氧离子自由基(0)的金属酶，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定，其催化反应为：2H+2O2 H2O2+O2 不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。

本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250 (Coomassic brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。 二、实验试剂与器材 [试剂] 1.SOD的提取

①ACD抗凝剂：柠檬酸10g柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml ②0.9%NaCl：称取NaCl 0.9g，溶于100ml蒸馏水中 ③丙酮 ④95%乙醇 ⑤氯仿 2.SOD活力测定

①50 mmol/L pH8.3磷酸缓冲液 ②10 mmol/L EDTA钠盐溶液

③3 mmol/L邻苯三酚溶液(用10mmol /L盐酸配制) 3.考马斯亮蓝G-250法测蛋白质

①考马斯亮蓝G-250试剂：称取l00mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。

②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。 [器材]

分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管(1ml，5ml)；离心机；烧杯(50ml)；

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