HIV-1 ADA株gp140真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)ADA株包膜蛋白(gp140)真核表达载体.方法 分别设计包膜蛋白和突变点两端的两对引物,采用重叠延伸剪接法,构建HIV-1ADA株包膜蛋白gp140突变体.获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行测序,鉴定正确后经EcoRⅠ和NheⅠ双酶切,与pcDNA6/myc-HisA载体连接,构建包膜蛋白gp140的真核表达载体(pcDNA6-ADAgp140),转化大

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第4 1卷第 4期 2 O O 7年 8月

哈尔滨医科大学学报 J OUR NAL OF HA RBI N MED I C札 U N][ vE RS玎Y

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A u g ., 2 0 O 7

3 03

H I V一 1 A D A株 g p l 4 0真核表达载体的构建与鉴定 李玉雪，王甲业，李庆海，李妍，凌虹 (哈尔滨医科大学微生物学教研室，黑龙江哈尔滨 1 5 0 0 8 1 ) [摘要] 目的 构建 I型人类免疫缺陷病毒 (ⅢV - 1 ) A D A株包膜蛋白( g p l 4 0 )真核表达载体。方法 分别设计包膜蛋白和突变点两端的两对引物，采用重叠延伸剪接法，构建 H I V . 1 A D A株包膜蛋白 g p l 4 0突变体。获得的 P C R产物

与p M D 1 8一 T载体连接，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行测序，鉴定正确后经 E c o R I和^%I双酶切，与p e D N A 6/ m y c - H i s A载体连接，构建包膜蛋白 g p l 4 0的真核表达载体 ( p c D N A 6 - A D A g p l 4 0 ),转化大肠杆菌后筛选阳性克隆，经

P C R及酶切进行鉴定。结果 获得 H I V - 1 A D A g p l 4 0的P C R产物，构建了其真核表达载体 p c D N A 6 - A D A g p l 4 0,经转化和筛选获得了重组菌，经P C R、酶切及基因测序结果显示序列正确，为预期目的片段。结论成功构建了 A D A s p 1 4 0 包膜蛋白的真核表达载体。此结果为深入研究 H I V包膜蛋白生物学特性及进行 H I V疫苗研究提供了良好的物质 基础。

[关键词] I型人类免疫缺陷病毒； g p l 4 0;重叠延伸剪接法 [中图分类号]R 3 7 3 [文献标识码]A [文章编号]1 0 0 0—1 9 o 5 ( 2 O O r 7 ) o 4一 O 3 o 3一o 3

C o n s t r u c i t o n a n d i d e n t i ic f a t i o n o f a n e u k a r y o i f c e x p r e s s i o n p l a s mi d e n c o d i ng HI V- 1 ADA g pl 4 0

U Y u - x u e, WA N G J i a - y e, H Q i n g - h a i, e t a l

( D e p a r t m e n t o fMi c r o b i o l o

g y, H a￣i n Me d c i a l U n i v e r s i t y, H a r b i n 1 5 0 0 8 1, C h i n a) A b s t r a c t: O b j e c i t v e T o c o n s t r u c t a n e x p r e s s i o n p l s a m i d b e a r i n g t h e g p l 4 0 e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n( e n v )g e n e o f HI V- 1 A DA s t r a i n . Me t h o d s T w o p a i r s o f p i f me￣f o r AD Ag p l 4 0 g e n e w e r e d e s i g n e d nd a o v e r l a p P ER w a s t a k e n p l a c d. e R e c o mb i n a n t p l sm a i d eD p NA 6 - A DAg p l 4 0 w a s c o st n r u c t d e b y l i g a t i n g p l smi a d e DN p A6/ m y c - Hi— s A nd a he t P C R p r o d u c t . T h e r e c o mb i n a n t p l s mi a d w a s i d e n t i f i d e w i h t P C R nd a DN A s e q u e n c i n g . Re s u l t s P C R p r o d u c t W s a o b t a i n d e nd a i se n r t d e i n t o p l a s mi d eD p N A 6一 AD Ag p l 4 0. T h e r e c o m b i n nt a p l s mi a d W s a t r a i l s - f o r me d i n t o E. c o l i . S e q u e n c i n g r e s u l t s h o w d e ha t t he t mo d i i f d e e n v h a d c o r r e c t n u c l e o t i d e s e q u e n c e . Co n c h- s i o n E x p r e s s i o n p l s mi a d f o r HI V - 1 A D A e n v g - p l d O i s c o st n r u c t d e s u c c e s s f u l l y . I t p mv i d s e p o s s i b i l i t y or f f u r - he

t r s t u d y o n he t b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f HI V e n v e l o e p g l y c o p r o t e i n nd a v a c c i n e. Ke y wo r d s:h u ma n i mmu n o d e ic f i e n c y v i r u s t y p e 1; g pl 4 0; S OE

I型人类免疫缺陷病毒 ( h u m n a i m mu n o d e i f c i e n c y v i r u s t y p e 1, H I V . 1 )包膜糖蛋白( g l y c o p r o t e i n, g P )由外

胞表面受体和辅助受体结合识别靶细胞，决定病毒 对不同靶细胞的亲嗜性，并在引起细胞病变及诱导

膜糖蛋白 g p l 2 0和跨膜糖蛋白 g p 4 1两部分组成，这

机体免疫反应方面发挥重要作用]。g p 4 1由膜外区、跨膜区和胞质区三个部分组成b],其膜外区直接介导了病毒包膜与细胞膜的融合，使病毒内容物释 放进入细胞。

两部分是由前体蛋白 g p l 6 0进入高尔基复合体后被 宿主细胞的蛋白水解酶裂解而来，两部分经非共价键结合，并形成异源三聚体结构…。g p l 2 0通过与细 [收稿日期】 2 0 o 7一 O 1—1 7 [基金项目】教育部重点研究项目( 2 0 6 0 4 3 );黑龙江省自然科学基金 重点项目( Z J Y 0 6 0 1 - O );哈尔滨市科技创新人才研究专项

由于 g p l 2 0和g p 4 1蛋白参与病毒进入靶细胞前的过程，因此是宿主抗病毒体液免疫反应的主要靶点，也是预防性 H I V疫苗设计中的重要候选免疫原。为获得可溶性的包膜蛋白以进一步研究其生物学特性并为 H I V包膜疫苗研究打下物质基础，本研 究通过去除跨膜区和胞质区截短 g p 4 1,同时突变

资金项目( 2 0 o 6砌 ( S 0 2 1 ) [作者简介】李玉雪 ( 1 9 7 8一),女，河北石家庄人，硕士研究生。 *通讯作者

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