血管内皮生长因子受体_2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

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严明，王静宜，胡洁，苗靖姗，何玲，张陆勇

（1.中国药科大学国家新药筛选实验室，南京210009；2.中国药科大学药学院

南京211198）药理教研室，

摘要：目的2抑制剂高通量药物筛选模型，利用均相时间分辨荧光（HTRF）技术建立血管内皮生长因子受体-从化合物样品

384低容量白板，使用20μL检测体系，采用均相时间分辨荧光技术对反应体系中的酶活性

库中寻找小分子抑制剂。方法

ATP和底进行荧光检测，进而评价待测样品的抑制活性。模型建立的体系优化包括如下实验步骤：酶浓度及反应时间优化，Z'因子的测定。在建立稳定模型检测体系物米氏常数测定，质控实验包括反应体系信噪比实验、抑制剂SU5416的IC50测定，之后，对本中心化合物库提供的10560个样品进行活性筛选，并对部分活性化合物进行IC50的测定。结果

在血管内皮生长

2活性体系优化实验中求得血管内皮生长因子受体-2激酶最适反应酶浓度为0.10ng·μL－1，因子受体-最适反应时间为15

－1min，ATPKm=0.75μmol·L－1，Z'值为0.85，底物Km=94.90nmol·L，信噪比底物：SA=2∶1，阳性药IC50=1.03μmol·

L－1。通过部分初筛活性样品进行复筛研究，14，S2-16、S2-38IC50分别为1.01×10－4，6.04×10－5，得到3个活性化合物S2-7.23×10－6mol·L－1。结论系进行应用推广。

2；血管新生；高通量筛选关键词：均相时间分辨荧光；血管内皮生长因子受体-中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1001－2494（2012）11－0894－05

2激酶高通量筛选模型，利用均相时间分辨荧光技术成功建立了血管内皮生长因子受体-并进

行了一定量的定向筛选研究，发现了若干先导化合物。本实验体系方法可靠，结果稳定，可作为抗血管新生天然产物筛选体

EstablishmentandApplicationofHighThroughputScreeningModelforKinaseInsertDomainReceptorWANGJing-yi1，HUJie1，MIAOJing-shan1，HELing2，ZHANGLu-yongYANMing1，

ChinaPharmaceuticalUniveristy，Nanjing211198，China）ABSTRACT：OBJECTIVE

ToestablishaKDRhighthroughputscreeningmodelwithhomogeneoustimeresolvedfluorescence

A20μL

1*

（1.NationalDrugScreen-

ingLaboratory，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanijng210009，China；2.DepartmentofPharmacology，SchoolofPharmacy，

（HTRF）detectiontechnologyinordertoscreensmallmolecularKDRinhibitorsfromthecompoundlibrary.METHODS

assaysystemin384-welllow-volumewhitemicroplatewasdevelopedwithHTRFbasedfluorescencedetectionsystemtodeterminetheenzymeactivity.Theoptimizationstepsconsistedofthefollowingexperiments：enzymeconcentrationandincubationtimeoptimiztion，ATPandsubstrateKmdetermination，qualitycontrolexperimentsincludingsignalnoiseratioinspection，theinhibitorSU5416IC50vali-dation，andZ'valuecalculation.Afterastableassaysystemwasaccomplished，aHTScampaignwasstartedwith10560samplesfromthecompoundlibraryandtheIC50ofsomecompoundsweredetermined.RESULTS

TheoptimizedKDRactivityassayconditionswere

asfollows：thekinaseconcentrationwas0.10ng·μL－1；ATPKmwas0.75μmol·L－1；substrateKmwas94.90nmol·L－1；biotin/SAratiowas2∶1；Z'valuewas0.85andtheIC50ofSU5416inhibitorwas1.03μmol·L－1.ThreecompoundswiththeIDofS2-14，S2-16，andS2-38showedIC50onKDRof1.01×10－4，6.04×10－5，7.23×10－6mol·L－1，respectively.CONCLUSION

A

KDRhighthroughputscreeningmodelhasbeensuccessfullyestablishedwithHTRFmethodologyandafocusedHTScampaignhasbeenaccomplishedwithseveralleads.Thisassaysystemisreliableandtheresultsarestable.Theestablishedassaysytemissuitableforfur-therapplicationinscreeningnaturalanti-angiogenesisproducts.

KEYWORDS：homogeneoustimeresolvedfluorescence；kinaseinsertdomainreceptor，vascularendothelialgrowthfactorkeceptor2；angiogenesis；highthroughputscreening

2（KDR），血管内皮生长因子受体-是一种重要的受体酪氨酸激酶，其在血管生成过程中起到十分重要的作用。血管生成参与许多病理生理

过程，如伤口愈合、局部缺血修复、子宫内膜周期

“重大新药创制”“十一五”002）；教育部中央高校基本科研业务费专项资金资助（ZJ10036）基金项目：国家科技重大专项计划（2009ZX09302-作者简介：严明，男，博士研究生，助理研究员Tel：（025）83271023·894·

Fax：（025）83271142

研究方向：分子药理学

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通讯作者：张陆勇，男，研究员研究方向：分子药理学

E-mail：lyzhang@cpu.edu.cn

中国药学杂志2012年6月第47卷第11期

ChinPharmJ，2012June，Vol.47No.11

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