纳豆激酶基因工程研究进展

中 国 生 物 工 程 杂 志

第23卷第9期

CHINABIOTECHNOLOGY

2003年9月

纳豆激酶基因工程研究进展

张淑梅

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李 晶 王玉霞 王佳龙 赵晓宇

(黑龙江省科学院应用微生物研究所 哈尔滨 150010)

摘要 纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtillis natto)分泌的一种具有纤溶作用的碱性丝氨酸蛋白酶。对纳豆激酶基因的克隆与表达,基因与蛋白质结构以及基因工程纳豆激酶的特性和功能进行了综述。

关键词 纳豆激酶 基因结构 基因工程 纳豆激酶(nattokinase)是日本学者须见洋行等人于1987年首次从纳豆中发现的。该酶是一种枯草杆菌蛋白激酶,是在纳豆发酵过程中由纳豆杆菌(Bacillussubtillis natto)产生的一种碱性丝氨酸蛋

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白酶。研究发现,纳豆激酶具有纤溶活性,能显著地溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白溶解时间,并能激活体内血管内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(t PA),从而增加内源性纤溶酶的量与作用,间接表现溶栓活性。因此,纳豆激酶是一种很有潜力的新型溶栓药物。目前常用的一些预防和治疗血栓的药物,如尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂(t PA)等,均存在一些缺陷,如半衰期短,用药剂量大,价格昂贵等等。与此相比,纳豆激酶具有安全性好,体内作用时间长,药效持久等优点,极有希望成为新一代理想的预防和治疗血栓的生化

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药物。本文综述了纳豆激酶的基因工程研究进展,同时评述了基因与蛋白质结构,探讨了不同的表达系统对表达产物的产量、活性和遗传稳定性的影响,为用基因工程菌生产纳豆激酶的进一步研究提供了一定的启示。

等利用鸟枪法得到了NK基因,并将NK基因重组到pUC19质粒上,转化到E.coliHB101受体菌中,该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋白酶活性,但没有检测其溶栓活性。至于对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的研究还未见报道。但与纳豆激酶同源性很高的枯草杆菌蛋白酶E和枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus都已有基因克隆的报道。

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Yoshimoto等利用穿梭质粒载体pHY300PLK克隆amylosacchariticus(apr)基因,转化到4种不同的枯草杆菌中(ISW1214,M1111,IA510,IA274),发现转化菌株(ISW1214 PTH1)的蛋白水解酶的产率比宿主

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菌和基因供给菌分别提高20倍和4倍。Mark等将枯草杆菌蛋白酶E基因克隆到穿梭载体pBS42上,转化枯草杆菌,表达的丝氨酸蛋白酶活性是野

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生型的5倍。凌均建等通过质粒整合和噬菌体pBS1转导构建了枯草杆菌蛋白酶E基因图谱。研究表明,克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只在静止生

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长期表达,并且受 37启动子的控制。Takagi等将枯草杆菌蛋白酶E基因克隆到嗜热表达载体上,实现了在嗜热杆菌中的表达。近年来,我国掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮,纳豆激酶的药用价值日益突出,我国学者渴望利用基因工程菌生产纳豆激酶,致使对纳豆激酶基因的克隆、表达、纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了很大进展。已经从不同菌株(枯草杆菌,纳豆杆菌,解淀粉芽孢杆菌)中克隆了纳豆激酶成熟肽基因,包括前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因,以及包括启动子,前导肽,信号肽和成熟肽的纳豆激酶全基因。分别重组到温控型和诱导型质粒载体上,实现了在大肠杆1 纳豆激酶基因克隆与表达

自从Nakamura等于1992年首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列,使得利用基因工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能。迄今为止,国外对纳豆激酶基因的研究仅限于Nakamura

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收稿日期:2003 05 16 修回日期:2003 08 05*黑龙江省自然科学基金资助项目(C01 23)**

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