荧光定量PCR技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用

第26卷 第2期 2007年2月 种 子 (Seed) Vo.l26 No.2 Feb. 2007

荧光定量PCR技术研究进展

及其在植物遗传育种中的应用

王 甜,陈庆富

(贵州师范大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所, 贵阳550001)

TheProgressofFluorescenceqPCRanditsApplicationinPlantGeneticsandBreeding

WANGTian,CHENQing fu

摘要:荧光定量PCR(FluorescenceinQuantitativePCR,FQ PCR)技术是20世纪90年代发展起来的一种新的核酸定量技术,具有高准确性、高特异性等特点,在生物科学和医学研究中发挥着极大的作用。本文综述了荧光定量PCR技术的原理、荧光探针类型及其在植物遗传育种中应用。关键词: 荧光定量PCR;FRET;荧光探针中图分类号: S5/59|03| 文献标志码: A文章编号: 1001 4705(2007)(02) 0056 06

点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化,以获得特定区段扩增产物定量的结果,不需要PCR后处理或电泳检测,完全闭管操作(整个过程中仅有加入样品的一次开盖),一举克服了常规PCR技术的诸多难题。

而荧光定量PCR技术真正进入市场化则是美国ABI公司在1996年推出了第一台荧光定量PCR仪,使得荧光定量PCR得以广泛应用

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自1985年,美国Perkin ElmerCetus公司人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),使人们梦寐

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以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。近年来,许多研究人员根据自身研究需要,在常规PCR技术的基础上,对经典的PCR技术进行了大量改进,进而衍生出多种新型的PCR技术,例如,免疫 PCR(Immune PCR)、巢式引物PCR(NestedprimerPCR)、反转录PCR(ReversetranscriptionPCR,简称RT)、反向PCR(ReversePCR)、荧光定量PCR(Fluorescencein

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QuantitativePCR,FQ PCR)等十多种类型。

荧光定量PCR(FQ PCR)最早是在1992年由日本人R.Higuchi提出的。他的基本思想是利用荧光染料EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质,在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程,根据PCR反应的数学函数关系,结合相应的算法,通过加入标准品的方法,就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi利用的是嵌入荧光染料检测,它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。

直到1995年,美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术,融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优

收稿日期:2006 11 03

作者简介:王 甜(1982-),女(布依族),贵州兴义人;硕士研究生,研

究方向:植物学研究。

通讯作者:陈庆富,E mai:lcqf1966@163.com。

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荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的方法。它可以从复杂的样品中检测出微量的目标核酸,具有高准确性、高特异性,即使是检测单分子也具有很高的敏感性。现在这门技术已经渗透到所有的分子学科和诊断应用,在生物科学研究和医学研究中发挥着极大的作用

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1 荧光定量PCR技术原理

荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。后者由于增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。二者各有优缺点,在不同的研究目的中被应用

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它们的基本原理是:扩增呈指数增长,在反应体系

和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量

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1.1 非特异性荧光定量PCR

非特异性荧光定量PCR主要是利用嵌入式荧光染料(如EB、YO PRO、YOYO、SYBRGreen等)与双链DNA结合发光的特性来指示扩增产物的增加量

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例如,SYBRGreen 只与DNA双链结合,插入DNA双链时荧光信号显著增强;当DNA变性时,双链解链

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